Крякунова Е.В., к.б .н . Хамидуллина Р.Г., к.б.н. Гимадутдинов О.А.

Казанский (Приволжский) федеральный университет,

Российская Федерация

ПОВЕДЕНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗS.MARCESCENSИANABAENASP. В ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ СИСТЕМАХE.COLI

В последние годы активно исследуются белки, участвующие в модификации нуклеиновых кислот, в том числе и нуклеазы, которые принимают участие в таких фундаментальных генетических процессах, как репликация, репарация и рекомбинация ДНК. Для получения необходимого белка в большом количестве наиболее часто используют штаммы, полученные на основе технологии рекомбинантной ДНК. С одной стороны, векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, дающие ей селективные преимущества, с другой стороны, сверхсинтез продукта чужеродного гена, как и сам продукт, могут оказывать негативное влияние на рост и размножение клеток . Эндонуклеазы Serratia marcescens и Anabaena species в последнее время находят широкое применение в биохимических исследованиях, молекулярной биологии, медицине и сельском хозяйстве. Однако их действие внутри гетерелогичных клеток практически не изучено.

Целью работы явилось определение влияния базального уровня экспрессии эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena species на физиологическое состояние рекомбинантных штаммов Escherichia coli .

В работе использовались плазмиды pHisNucSma и pHisNucA , несущие гены исходных и мутантных эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp ., принадлежащих к одному семейству эндонуклеаз. При замене His в 89 положении на Ala у эндонуклеазы S . marcescens и His в 124 положении на Ala у Anabaena sp . были получены функционально неактивные белки. Замена Arg в 57 положении на Ala снижает активность нуклеазы S . marcescens на 65%, а замена Trp в 159 положении на Ala дает 10% от активности нуклеазы Anabaena sp . Кроме того, плазмиды содержат ген b - лактамазы, необходимый для селекции клеток, содержащих данную плазмиду. Транскрипционная активность гена эндонуклеазы регулируется С1 -репрессором, термочувствительным у штаммов TGE 900 и нормальным у штаммов LK 111 l .

Методом йодометрического титрования было установлено количество ?- лактамазы, синтезируемое каждым рекомбинантным штаммом: ?-лактамазная активность гораздо выше у штаммов, несущих плазмиды pHisNucSma , чем у штаммов с плазмидами pHisNucA . Также было показано, что ?- лактамазная активность у клеток с нуклеазой S . marcescens возрастает с увеличением активности нуклеазы: наибольшая ?-лакта-мазная активность наблюдается у клеток E . coli с нуклеазой S . marcescens дикого типа, наименьшая – у клеток с неактивной нуклеазой. При наличии в клетках эндонуклеазы Anabaena sp . наблюдается обратная картина: наибольшей ?- лактамазной активностью обладает штамм с неактивной нуклеазой, наименьшей – с нуклеазой дикого типа. Т.к. увеличение количества ?- лактамазы в клетках сопровождается увеличением уровня резистентности к ампициллину и поскольку ген ?-лактамазы находится в вышеописанных плазмидах, то такие изменения, скорее всего, являются следствием увеличения числа копий плазмиды.

Еще одним доказательством присутствия в клетках штаммов TGE 900 большего числа копий плазмиды pHisNucSma по сравнению с LK 111 l могут служить зоны обесцвечивания, образующиеся при гидролизе ДНК нуклеазой на индикаторном агаре, содержащем краситель толуидиновый голубой и высокополимерную ДНК. Такие зоны, образуемые эндонуклеазой Anabaena sp . у штаммов TGE 900 значительно меньше, чем у соответствующих штаммов LK 111 l . Также зоны обесцвечивания, образуемые нуклеазами с промежуточными активностями, по площади примерно равны их процентной активности относительно зоны обесцвечивания, образуемой соответствующей нуклеазой дикого типа, и отсутствуют у штаммов с неактивной нуклеазой и у бесплазмидных штаммов.

Налидиксовая кислота и новобиоцин являются агентами, подавляющими действие ДНК-гиразы – фермента, разрешающего топологические проблемы, связанные со спирализацией-деспирализацией ДНК . Налидиксовая кислота связывается с А-субъединицей ДНК-гиразы, ответственной за связывание фермента с субстратом, т.е. ДНК. Наибольшая устойчивость к этому агенту наблюдается у клеток с нуклеазой S . marcescens дикого типа, что может свидетельствовать о вероятном участии в репликации данной нуклеазы, действующей подобно ДНК-гиразе , инициирующей образование « ников » в области ori . Устойчивость к налидиксовой кислоте у штамма с нуклеазой Anabaena sp . дикого типа меньше, чем у бесплазмидного штамма. Это может объясняться ее повышенной токсичностью для клетки по сравнению с нуклеазой S . marcescens , что подтверждается присутствием данной плазмиды в клетках всего в 1-2 копиях. Новобиоцин связывается с В-субъединицей ДНК-гиразы , блокируя ее ферментативные функции посредством ингибирования АТФ-зависимой сверхспирализации ДНК гиразой . Было показано, что существенных отличий уровней устойчивости к новобиоцину между рекомбинантными штаммами как с эндонуклеазой S . marcescens , так и с эндонуклеазой Anabaena sp . , и соответствующими бесплазмидными штаммами не наблюдается. Вероятно, эндонуклеазы S . marcescens и Anabaena sp . не способны заменить действие В-субъединицы ДНК-гиразы по восстановлению нативной структуры фермента после одного раунда репликации.

Репликативный синтез плазмидной ДНК, сверхсинтез продукта чужеродного гена являются дополнительной метаболической нагрузкой для клетки-хозяина, поэтому в неселективных условиях плазмида будет элиминировать из клетки. Для выяснения того, насколько стабильно данная плазмида наследуется в ряду клеточных поколений, а также для доказательства того, что изменения в уровне резистентности к антибиотику у рекомбинантных штаммов не связаны с мутациями штамма-хозяина или с транспозицией гена устойчивости из плазмиды в хромосому, необходимо показать, что вместе с утратой плазмиды происходит и утрата способности расти на средах с ампициллином . Известно, что эндонуклеазы S. marcescens и Anabaena sp . предпочтительно расщепляют А-форму ДНК по сравнению с В-формой. Скорее всего, нуклеазы разрезают область origin , модифицированную интеркаляцией используемого в качестве элиминирующего агента бромистого этидия в А-форму, тем самым заменяя инициирующее репликацию действие ДНК-топоизомеразы .

Обработка этидиум бромидом даже в малых дозах приводила к резкому снижению выживаемости бактерий. Выжившие клетки анализировали на потерю маркера устойчивости к ампициллину . С увеличением концентрации этидиум бромида прои c ходило увеличение процента элиминации, однако у рекомбинантных штаммов E. coli TGE900 утрата плазмид происходит с более высокой частотой, чем у соответствующих штаммов LK 111? . Для клеток, несущих гены эндонуклеаз S. marcescens , была установлена обратная корреляция между процентом элиминировавших плазмид и активностью нуклеаз: наименьший процент элиминации наблюдался для клеток с нуклеазами дикого типа, средний – для нуклеаз с промежуточной активностью и максимальный – для неактивной формы нуклеазы. В присутствии же в клетках эндонуклеазы Anabaena sp . наиболее стабильными себя показали плазмиды с генами нуклеазы с промежуточными активностями, наименее же стабильными оказались плазмиды, несущие гены неактивных эндонуклеаз и эндонуклеаз дикого типа, что также может объясняться высокой токсичностью эндонуклеазы Anabaena sp . дикого типа.

Данные результаты имеют как научный, так и практический интерес, поскольку могут быть использованы в биотехнологии при создании рекомбинантных штаммов, обладающих способностью к сверхсинтезу белка за счет увеличения дозы его гена.