Гарда С. О., к. т. н. Даниленко С. Г., Панасюк І. В.
Інститут продовольчих ресурсів, м. Київ, Україна
ПРОБІОТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ
Використання мікроорганізмів для створення пробіотиків для сільськогосподарських птахів є перспективним напрямом сучасної біотехнології, що постійно розвивається.
При підборі пробіотичних культур для функціональних продуктів існують певні особливі правила. Мікроорганізми перевіряють на стійкість до агресивних метаболітів макроорганізму, низької кислотності (це необхідна умова здійснення транзиту через верхні відділи шлунку). Крім того, вони повинні відрізнятися високою колонізаційною резистентністю, тобто бути здатними до адгезії, проявляти антагоністичну активність стосовно патогенних мікроорганізмів, бути безпечними та не мати побічних дій на макроорганізм тощо.
Першою перешкодою, що постає перед мікроорганізмами, які поступають з продуктами, є травна система. Тому перевагу мають ті штами, що є резистентними до шлункового соку та ряду інших метаболітів макроорганізму (жовч, фенол та хлорид натрію).
У тонкому кишечнику пробіотичні бактерії піддаються дії жовчних кислот, які згубно діють на них пошкоджуючи клітинні мембрани та інактивують ферменти.
Стійкість до жовчі, загалом, є штамовою ознакою і визначається природними особливостями окремих культур. Проте, змінюючи умови культивування мікроорганізмів можна певною мірою підвищіти цю здатність.
Так формування стійкості до жовчних кислот у грампозитивних мікроорганізмів забезпечується ущільненням клітинної стінки, зміні структури та функцій ферментів. Встановлено, що інтенсивність згубної дії жовчі на клітини мікроорганізмів залежить від тривалості контакту з нею та її концентрації.
Метою даної роботи було дослідження перспективних пробіотичних штамів лактобацил та біфідобактерій до дії шлункового соку (кислотостійкість) та жовчі.
Об’єктами дослідження були штами молочнокислих бактерій Lасtobacillus rhamnosus , L. plantarum , та штам біфідобактерій Bifidobacterium longum , виділений із птиці та кишківника поросяти, з колекції промислових штамів відділу біотехнології Інституту продовольчих ресурсів НААН.
Кислотостійкість промислових пробіотичних мікроорганізмів має визначальне значення не тільки як критерій життєздатності клітин, під час транзиту через шлунок з його високою концентрацією НСl , але й у забезпеченні гарантованої чисельності у функціональних продуктах в процесі зберігання.
Стійкість до низького рН перспективних штамів молочнокислих та біфідобактерій оцінювали у наступних дослідах: 12 годинні культури, вирощені у відповідних поживних середовищах, підкислювали соляною кислотою до рН 3 та рН 2 і молочною кислотою до рН 4 і рН 3. У такий спосіб відтворювали умови шлунку. Після цього культури витримували у термостаті за температури 37 о С протягом 5 і 24 годин. Відразу після підкислення, через 1, 3 і 5 год експозиції визначали чисельність мікроорганізмів, відтворюючи таким чином у деякому наближенні природні умови.
Усі дослідження повторювали тричі. Статистичну обробку результатів проводили за традиційними методами варіаційної статистики з використанням програми Exel .
Було встановлено, що обстежені штами молочнокислих бактерій істотно різняться за стійкістю до соляної кислоти – відразу після підкислення кількість втрачених клітин коливалась від 8 до 69% від висхідної. Всі штами показали доволі високу чутливість до HCl .
Частка вражених клітин відразу після підкислення ферментованого молока була більшою за рН 2, ніж рН 3. Стійкішими до соляної кислоти виявилися біфідобактерії . Їхня чисельність відразу знизилася лише на 2,3–13% від вихідної. При цьому істотних розбіжностей у чисельності клітин, що вижили, як для окремих культур, так і за рН 3 і рН 2 не спостерігали.
Із двох штамів L. plantarum стійкішим до НСІ виявився штам вилучиней із кишківника поросят. Він зберігав чисельність своєї популяції на одному рівні протягом 5 год за обох значень рН 2 і рН 3. Швидкість відмирання його клітин була досить низькою – близько 0,18 год -1 . Штам L. plantarum , виділений із птиці, був стійким протягом 3 год за рН 3, однак, підкислення до рН 2 згубніше діяло на цю культуру, про що свідчить високе значення швидкості відмирання ( m = – 0,58 год -1 ).
Для скринінгу жовчостійких штамів молочнокислих бактерії застосовувалиу середовище МРС без та з додаванням 20% медичного препарату жовчі до досягнення оптичної густини Е=0,300. Було встановлено, що термін, необхідний для досягнення цього значення густини популяції, коливався для досліджених штамів в широких межах – від 3,5 до 5,5 год. Найшвидше розвивалися у присутності 20% медичної жовчі штамм Lасtobacillus rhamnosus затримка росту становила 3,5 год
Збільшення концентрації жовчі до 30 та 40% значно знижувало життєздатність клітин молочнокислих бактерій.
Скринінг жовчостійких штамів біфідобактерій проводили застосовуючи метод F.A.M.Klaver & R.Van der Meer з використанням сухого препарату жовчі (« Оxgall » фірми Sigma ), що є сумішшю кон’югованих жовчних солей. Попередньо стерилізований розчин препарату додавали із розрахунку 0,3% до середовища Блаурокк , в якому культивували біфідобактерії упродовж 24 год за температури 37 о С . штами біфідобактерій істотно розрізнялися за жовчостійкістю . Фаза затримки росту коливалась у широких межах – від 2 до 4,5 годин.
В цілому досліджені культури молочнокислих та біфідобактерій характеризувалися високим ступенем стійкості до соляної та молочної кислот протягом тривалого контакту з ними, та показали високу стійкість до жовчних кислот, що можна розглядати як гарант їхньої життєздатності.